CRISPR/Cas9 pour réparer le gène DEB (2025)

Ce projet d'un an a fourni des preuves préliminaires de l'utilisation d'une méthode de thérapie génique CRISPR/Cas9 appelée réparation dirigée par homologie (HDR) pour traiter l'EB. Les chercheurs ont utilisé la HDR dans des cellules prélevées sur des biopsies cutanées de cinq personnes atteintes d'EB dystrophique. Leur procédé a permis d'introduire les molécules d'édition génique dans les cellules en laboratoire grâce à une impulsion électrique (électroporation) plutôt qu'à des virus modifiés (vecteurs viraux). Ils ont constaté qu'ils pouvaient corriger efficacement les modifications génétiques dans deux cas, partiellement dans un cas, et que cette correction était inefficace dans les deux autres. Ces travaux ont montré que la HDR pourrait potentiellement être utilisée en thérapie génique de l'EB, mais qu'elle nécessiterait une optimisation individuelle pour chaque patient.

L'avancement du projet a été présenté au Congrès collaboratif ESGCT/SITGEC (Rome, Italie) du 22 au 25 octobre 2024. Numéro d'affiche P1008. Voir l'affiche.

À mi-chemin du projet, les chercheurs rapportent qu’ils ont atteint la moitié de leurs objectifs. Leurs « patchs » génétiques fonctionnent plus efficacement que prévu, mais sont plus petits. Cela signifie qu’ils en auront besoin davantage et qu’ils se concentreront là-dessus pour la seconde moitié du projet.

Chercheur principal : Le Dr Sergio López-Manzaneda est un chercheur au CIEMAT avec une solide expérience dans l'édition du génome.

Co-chercheurs : Le Dr Fernando Larcher est professeur agrégé de biochimie à l'Université Carlos III de Madrid et chef de division au CIEMAT (Division de biomédecine épithéliale).

Alex Bassons Bascuñana est doctorant au sein du groupe de biomédecine épithéliale de l'unité d'innovation biomédicale du CIEMAT.

Collaboration: Le Dr Paula Rio est une experte internationalement reconnue en matière d'édition génétique et de thérapie génique des maladies hématopoïétiques héréditaires, de la science fondamentale aux essais cliniques.

« Cette approche d’édition génétique non virale recherche une stratégie universelle et peu coûteuse pour générer une bibliothèque d’outils capables de traiter toutes les mutations connues… Dans de futures études précliniques, des kératinocytes et des fibroblastes modifiés par « patch » génétique provenant de patients seront utilisés pour générer des équivalents cutanés issus du génie biologique. »

– Dr Sergio López-Manzaneda

Titre de la subvention : Correction d'édition du génome non viral de COL7A1.

Dans ce projet, nous proposons une stratégie d’édition du génome axée sur le traitement non pas d’une seule mutation ponctuelle mais de groupes de mutations voisines provoquant le RDEB, en réparant les exons entiers qui les hébergent. Ce « patching génétique » est basé sur le mécanisme naturel de réparation de l’ADN par recombinaison homologue (HR) facilité par le système CRISPR/Cas9. Les « patchs » représentent de petits modèles d’ADN donneur HDR double brin (300-400 paires de bases) qui seraient conçus à partir de séquences de gènes suffisantes pour couvrir quelques exons contigus, dans ce cas, correspondant au gène COL7A1 codant le collagène de type VII. Notre objectif est de caractériser (efficacité, sécurité) et de standardiser l’utilisation de cette technologie avec l’idée d’avoir des patchs spécifiques facilement disponibles pour s’attaquer à des groupes individuels de mutations. La technologie non virale proposée pour le traitement ex vivo des cellules de patients atteints de RDEB facilitera sa traduction en clinique à faible coût.

L’une des approches thérapeutiques les plus prometteuses pour l’EB est l’édition du génome à l’aide des technologies CRISPR/Cas9. Au cours des 7 dernières années, notre laboratoire a travaillé activement dans ce domaine en fournissant de solides données de preuve de concept visant à traduire ses résultats en clinique. Alors que nous sommes à la veille d’une application clinique avec l’une de ces approches qui a obtenu la désignation de médicament orphelin par l’Agence européenne des médicaments (UE/3/20/2253), nous continuons à rechercher des stratégies d'édition du génome plus efficaces, plus sûres et cliniquement pertinentes.

Dans ce projet, nous proposons de tester une approche innovante d’édition de gènes qui ne nécessite pas l’utilisation de vecteurs viraux (tout le matériel est introduit par une seule électroporation). L’objectif est d’utiliser ces « patchs génétiques » pour corriger des régions mutées après avoir coupé cette région génétique avec la technologie CRISPR/Cas9. Nous avons conçu quatre « patchs » différents, c’est-à-dire des modèles donneurs d’ADN double brin spécifiquement modifiés à leurs extrémités par une technologie propriétaire de notre fournisseur (Integrated DNA technologies, IDT) pour favoriser le HDR. Ces modèles contiennent deux exons et leurs environs (73 et 80, deux « patchs » chacun) et quatre points de coupure différents (deux pour l’exon 73 et deux pour l’exon 80). Ces modèles (environ 300-400 pb) couvrent également les exons voisins.

Notre objectif est d'évaluer l'étendue de la réparation au sein des « patchs », ce qui nous permettrait d'adresser des groupes de mutations ou, si le système fonctionne suffisamment bien, de corriger complètement les exons au sein des « patchs ». Nous pensons que cette nouvelle stratégie d’édition génétique personnalisée, non virale, pourrait être facilement transposée en clinique à un coût économique très faible.

Nous avons atteint avec succès la moitié des jalons de la subvention. Initialement, notre stratégie visait à réécrire le génome en utilisant des « patchs » d’ADN pour couvrir des paires d’exons (en ciblant spécifiquement les mutations dans les paires d’exons : 72-73, 73-74, 79-80 et 80-81). Cependant, les patchs d’ADN que nous avons utilisés se sont avérés légèrement différents de ce que nous attendions. Ces patchs peuvent réécrire le génome avec une efficacité supérieure à 80 %, ce qui est supérieur à ce qui avait été rapporté précédemment, mais leur action est limitée à une fenêtre étroite. Compte tenu de cela, notre stratégie de phase 2 se concentrera désormais sur des patchs d’ADN individuels pour chaque exon. Pour garantir que nous ne modifions pas les séquences d’ADN saines, la « coupure moléculaire » CRISPR/Cas9 ne ciblera que les séquences mutées. Cela nécessitera des petits ARN spécifiques pour chaque mutation, tandis qu’un patch d’ADN commun peut être utilisé pour chaque exon. (Extrait du rapport de juillet 2024).

Initialement, notre stratégie visait à réécrire le génome à l'aide de « patchs » d'ADN couvrant des paires d'exons, ciblant spécifiquement les mutations des paires d'exons 72-73, 73-74, 79-80 et 80-81. Cependant, les patchs d'ADN utilisés différaient légèrement de nos attentes. Contrairement aux stratégies HDR classiques, ce nouveau système IDT (Integrated DNA Technologies) ne peut réécrire des séquences au-delà de 30 nucléotides, limitant ainsi son action à une fenêtre étroite.

Dans ce contexte, notre stratégie de phase 2 s'est concentrée sur des fragments d'ADN individuels pour chaque exon. Afin de garantir l'intégrité des séquences d'ADN saines, la « coupe moléculaire » CRISPR/Cas9 cible uniquement les séquences mutées. Cela nécessitait des petits ARN spécifiques pour chaque mutation, tandis qu'un fragment d'ADN commun pouvait être utilisé pour chaque exon. Nous avons réussi à réécrire l'ADN avec une efficacité élevée (> 70 %) pour deux mutations sur cinq (patient 2 et patient 5), une efficacité modérée (> 2 %) pour deux autres (patient 73.4 et patient 25), et à peine modifié une mutation (2 %) (E73.2). Bien que le tri des clones corrigés soit une stratégie envisageable, leur utilisation pour la transplantation présenterait un défi technique lors des essais cliniques si l'on partait de faibles taux d'efficacité. Néanmoins, ces travaux offrent au moins deux alternatives thérapeutiques prometteuses pour les mutations c.2_5delAG et c.73.3G>A, en utilisant une approche HDR non virale plutôt que le système traditionnel d'administration par vecteur viral. (Extrait du rapport final de mars 6041.)