CRISPR/Cas9 pour réparer le gène DEB (2025)

This one-year project provided preliminary evidence for using a method of CRISPR/Cas9 gene therapy called homology directed repair (HDR) to treat EB. The researchers used HDR in cells taken from skin biopsies from five people with dystrophic EB. Their process delivered the gene editing molecules into the cells in the laboratory using a pulse of electricity (electroporation) instead of modified viruses (viral vectors). They found that they could correct genetic changes effectively in two cases, to some extent in one, and in the other two it was not effective. This work showed that HDR could potentially be used in EB gene therapy but would need to be optimised for each patient individually.

The progress of the project has been presented to the ESGCT/SITGEC Collaborative Congress (Rome, Italy) 22-25 October 2024. Poster number P1008. Voir l'affiche.

À mi-chemin du projet, les chercheurs rapportent qu’ils ont atteint la moitié de leurs objectifs. Leurs « patchs » génétiques fonctionnent plus efficacement que prévu, mais sont plus petits. Cela signifie qu’ils en auront besoin davantage et qu’ils se concentreront là-dessus pour la seconde moitié du projet.

Chercheur principal : Le Dr Sergio López-Manzaneda est un chercheur au CIEMAT avec une solide expérience dans l'édition du génome.

Co-chercheurs : Le Dr Fernando Larcher est professeur agrégé de biochimie à l'Université Carlos III de Madrid et chef de division au CIEMAT (Division de biomédecine épithéliale).

Alex Bassons Bascuñana est doctorant au sein du groupe de biomédecine épithéliale de l'unité d'innovation biomédicale du CIEMAT.

Collaboration: Le Dr Paula Rio est une experte internationalement reconnue en matière d'édition génétique et de thérapie génique des maladies hématopoïétiques héréditaires, de la science fondamentale aux essais cliniques.

« Cette approche d’édition génétique non virale recherche une stratégie universelle et peu coûteuse pour générer une bibliothèque d’outils capables de traiter toutes les mutations connues… Dans de futures études précliniques, des kératinocytes et des fibroblastes modifiés par « patch » génétique provenant de patients seront utilisés pour générer des équivalents cutanés issus du génie biologique. »

– Dr Sergio López-Manzaneda

Titre de la subvention : Correction d'édition du génome non viral de COL7A1.

Dans ce projet, nous proposons une stratégie d’édition du génome axée sur le traitement non pas d’une seule mutation ponctuelle mais de groupes de mutations voisines provoquant le RDEB, en réparant les exons entiers qui les hébergent. Ce « patching génétique » est basé sur le mécanisme naturel de réparation de l’ADN par recombinaison homologue (HR) facilité par le système CRISPR/Cas9. Les « patchs » représentent de petits modèles d’ADN donneur HDR double brin (300-400 paires de bases) qui seraient conçus à partir de séquences de gènes suffisantes pour couvrir quelques exons contigus, dans ce cas, correspondant au gène COL7A1 codant le collagène de type VII. Notre objectif est de caractériser (efficacité, sécurité) et de standardiser l’utilisation de cette technologie avec l’idée d’avoir des patchs spécifiques facilement disponibles pour s’attaquer à des groupes individuels de mutations. La technologie non virale proposée pour le traitement ex vivo des cellules de patients atteints de RDEB facilitera sa traduction en clinique à faible coût.

L’une des approches thérapeutiques les plus prometteuses pour l’EB est l’édition du génome à l’aide des technologies CRISPR/Cas9. Au cours des 7 dernières années, notre laboratoire a travaillé activement dans ce domaine en fournissant de solides données de preuve de concept visant à traduire ses résultats en clinique. Alors que nous sommes à la veille d’une application clinique avec l’une de ces approches qui a obtenu la désignation de médicament orphelin par l’Agence européenne des médicaments (UE/3/20/2253), nous continuons à rechercher des stratégies d'édition du génome plus efficaces, plus sûres et cliniquement pertinentes.

Dans ce projet, nous proposons de tester une approche innovante d’édition de gènes qui ne nécessite pas l’utilisation de vecteurs viraux (tout le matériel est introduit par une seule électroporation). L’objectif est d’utiliser ces « patchs génétiques » pour corriger des régions mutées après avoir coupé cette région génétique avec la technologie CRISPR/Cas9. Nous avons conçu quatre « patchs » différents, c’est-à-dire des modèles donneurs d’ADN double brin spécifiquement modifiés à leurs extrémités par une technologie propriétaire de notre fournisseur (Integrated DNA technologies, IDT) pour favoriser le HDR. Ces modèles contiennent deux exons et leurs environs (73 et 80, deux « patchs » chacun) et quatre points de coupure différents (deux pour l’exon 73 et deux pour l’exon 80). Ces modèles (environ 300-400 pb) couvrent également les exons voisins.

Notre objectif est d'évaluer l'étendue de la réparation au sein des « patchs », ce qui nous permettrait d'adresser des groupes de mutations ou, si le système fonctionne suffisamment bien, de corriger complètement les exons au sein des « patchs ». Nous pensons que cette nouvelle stratégie d’édition génétique personnalisée, non virale, pourrait être facilement transposée en clinique à un coût économique très faible.

Nous avons atteint avec succès la moitié des jalons de la subvention. Initialement, notre stratégie visait à réécrire le génome en utilisant des « patchs » d’ADN pour couvrir des paires d’exons (en ciblant spécifiquement les mutations dans les paires d’exons : 72-73, 73-74, 79-80 et 80-81). Cependant, les patchs d’ADN que nous avons utilisés se sont avérés légèrement différents de ce que nous attendions. Ces patchs peuvent réécrire le génome avec une efficacité supérieure à 80 %, ce qui est supérieur à ce qui avait été rapporté précédemment, mais leur action est limitée à une fenêtre étroite. Compte tenu de cela, notre stratégie de phase 2 se concentrera désormais sur des patchs d’ADN individuels pour chaque exon. Pour garantir que nous ne modifions pas les séquences d’ADN saines, la « coupure moléculaire » CRISPR/Cas9 ne ciblera que les séquences mutées. Cela nécessitera des petits ARN spécifiques pour chaque mutation, tandis qu’un patch d’ADN commun peut être utilisé pour chaque exon. (Extrait du rapport de juillet 2024).

Initially, our strategy aimed to rewrite the genome using DNA “patches” to cover pairs of exons, specifically targeting mutations in exon pairs 72-73, 73-74, 79-80, and 80-81. However, the DNA patches used differed slightly from our expectations. Unlike classical HDR strategies, this new IDT (Integrated DNA Technologies) system cannot rewrite sequences beyond 30 nucleotides, limiting its action to a narrow window.

Given this, our phase 2 strategy focused on individual DNA patches for each exon. To ensure that healthy DNA sequences remain unmodified, the CRISPR/Cas9 “molecular cut” targets only mutated sequences. This required specific small RNAs for each mutation, while a common DNA patch could be used for each exon. We successfully rewrote the DNA at a high efficiency (>70%) in 2 out of 5 mutations (patient 2 and patient 73.4), achieved moderate efficiency (>25%) in 2 others (patient 73.2 and patient 2), and barely modified one (5%) (E73.3). Although sorting corrected clones is a feasible strategy, using these clones for transplantation would present a technical challenge in clinical trials if starting from low efficacy rates. Nevertheless, this work provides at least two promising therapeutic alternatives for the mutations c.6041_6042delAG and c.6100G>A, utilizing a non-viral HDR approach instead of the traditional viral vector delivery system. (From March 2025 final report.)