Thérapie génique pour EBS et RDEB (2022)

Malgré la difficulté d'obtenir des échantillons de peau pendant la période de restrictions de Covid, les chercheurs ont montré que leur traitement pouvait permettre de manquer le changement génétique qui fait que le RDEB est manqué ("saut d'exon") dans la peau ainsi que dans les cellules d'un plat. L'injection du traitement dans des échantillons de peau laissés par des procédures chirurgicales a entraîné un niveau faible mais détectable de saut d'exon dans l'étape précédant la fabrication de la protéine de collagène. Les chercheurs suggèrent que des travaux supplémentaires seraient nécessaires pour montrer si cela permettait de fabriquer suffisamment de protéines de collagène actives pour réduire les symptômes de RDEB.

L'utilisation de petits morceaux d'acide nucléique (comme l'ADN) pour aider à fabriquer du collagène et de la kératine à partir de gènes RDEB ou EBS cassés s'est révélée prometteuse dans les cellules. Il a été plus difficile de montrer les effets sur la peau, où ces petits morceaux d'acide nucléique thérapeutique semblent fonctionner différemment. Les chercheurs ont publié une étude évaluation des progrès dans ce domaine en 2021. 

Ce projet s'appuie sur les travaux publiés par les chercheurs en 2019 :

• Le saut d'exon naturel ouvre la voie à une thérapie par saut d'exon pour l'épidermolyse bulleuse dystrophique : thérapie moléculaire – acides nucléiques (cell.com)
• Thérapies contre l'épidermolyse bulleuse : la délivrance est la clé – Bremer – 2019 – British Journal of Dermatology – Wiley Online Library

Université de Dundee rapporté sur le projet en 2019.

Chercheurs principaux :

Dre Robyn Hickerson est un chercheur principal au sein de l'École des sciences de la vie avec un groupe de recherche actif axé principalement sur le développement de thérapies pour les maladies génétiques rares de la peau.
Dr Peter van den Akker, DEBRA Clinical Research Fellow, est un généticien clinique expérimenté et a concentré sa carrière de chercheur sur les thérapies à base d'ARN pour le RDEB et d'autres génodermatoses.

Co-chercheur :

Dr Aileen Sandilands possède une vaste expérience de 19 ans dans le groupe dans les troubles génétiques de la peau et le développement de systèmes de saut d'exon dans le but de traiter les troubles génétiques de la peau

« Notre objectif ultime est de développer des thérapies pour toutes les formes d’EB… En nous appuyant sur les résultats passionnants et encourageants de nos travaux précédents, nous prévoyons désormais d’optimiser l’efficacité du saut d’exon dans nos modèles de peau humaine ex vivo et in vivo, afin de nous rapprocher d’un essai clinique »

Dr Robyn Hickerson et Dr Peter Van den Akker

Titre de la subvention : Développement d'une nouvelle technologie génétique pour le traitement de l'épidermolyse bulleuse simple (EBS) et de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (RDEB)

Environ 70 % des cas d'épidermolyse bulleuse (EB) sont classés comme EB simplex (EBS), qui est causée par des mutations (erreurs) dans les gènes qui fabriquent des protéines appelées kératine 5 et kératine 14 (KRT5 et KRT14). Les kératines sont essentielles pour assurer une peau forte et saine. Il n'existe aucun traitement efficace pour l'EBS, qui se caractérise par des cloques persistantes et une mauvaise cicatrisation de la peau, tant à l'intérieur qu'à l'extérieur. Les gènes sont hérités, une copie de chaque parent. Une seule copie du gène doit contenir une mutation pour provoquer l'EBS - ceux-ci sont appelés gènes dominants. En supprimant sélectivement l'expression de la copie défectueuse du gène, cela permet à la copie normale du gène de fonctionner correctement, une stratégie qui pourrait être développée en une thérapie appropriée pour l'EBS.
L'objectif initial de ce projet était de développer une nouvelle technologie pour le silençage génique thérapeutique dans l'EBS. Lorsque la séquence génétique ou d'ADN d'un gène est lue, comme une recette, elle est finalement traduite par une étape intermédiaire (ARN messager) dans la production de protéines - dans ce cas, les kératines trouvées dans la couche supérieure de la peau, la épiderme. De nouveaux développements en technologie génétique signifient qu'il est désormais possible de synthétiser un petit morceau d'acide nucléique qui se liera à l'ARN messager et l'inactivera. C'est ce qu'on appelle la technologie de silençage génique. Les oligonucléotides antisens (ASO) sont de petits morceaux d'acide nucléique qui peuvent être conçus pour se lier spécifiquement aux copies d'ARN messager d'un certain gène afin de les détruire.

Le chargé de recherche clinique a été chargé de développer cette nouvelle technologie de silençage génique au point où elle pourrait être appliquée à la clinique. L'équipe de Dundee a travaillé avec la société pharmaceutique Vague Sciences de la vie sur ce projet et ont identifié plusieurs ASO capables de faire taire l'ARN messager KRT14 dans les cellules de peau humaine cultivées en laboratoire.

L'utilisation d'ASO pour l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (une forme plus grave d'EB) est tout aussi difficile. L'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (RDEB) est causée par des défauts du gène COL7A1, la recette génétique de la protéine collagène de type 7. Tout le monde porte deux copies de COL7A1, mais, contrairement à l'EBS, il doit y avoir une mutation sur les deux copies du gène pour présenter les symptômes de RDEB - ce sont des gènes récessifs. L'approche pour détruire l'ARN messager défectueux ne fonctionnera pas ici. Cependant, une classe différente d'ASO peut être utilisée, ce qui peut inciter les cellules à éliminer la partie de l'ARN messager où se trouve la mutation. Cette approche est appelée « saut d'exon » et bien que cela conduira à un ARN messager légèrement plus court, elle peut toujours être utilisée pour produire du collagène de type 7 actif (mais plus court). Dans une étude de la littérature, le boursier a découvert que les personnes chez qui le saut d'exon se produit naturellement (sans l'utilisation d'ASO mais plutôt en raison d'une variation supplémentaire de l'ADN) ont toujours une forme de DEB, mais celle-ci est plus douce que d'habitude. Ceci souligne que le saut d'exon est une stratégie thérapeutique prometteuse. L'équipe de Dundee a conçu plusieurs ASO capables d'induire le saut d'exon de COL7A1 dans les cellules cutanées humaines cultivées en laboratoire.

Nouvelle technologie antisens pour l'EB - optimisation du saut d'exon dans la peau humaine (Clinical Research Fellowship Year 5).

Les patients atteints de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (RDEB), maladie génétique de la peau, souffrent d'une peau extrêmement fragile en raison de l'absence d'une protéine clé (collagène 7) qui maintient les couches de la peau ensemble. Chez les patients atteints d'EBDR, des fautes d'orthographe ("mutations") dans le gène qui code pour la protéine de collagène 7 empêchent l'organisme de la fabriquer. À l'Université de Dundee, nous essayons de contourner les fautes d'orthographe dans le gène du collagène 7 en ciblant l'étape qui se produit avant la fabrication de la protéine. Avant que la protéine de collagène 7 ne soit fabriquée, le gène fait d'abord une copie portable de lui-même, cette copie est appelée ARN messager et est utilisée comme matrice pour fabriquer la protéine. Chez les patients RDEB, la copie de l'ARN messager contient les mêmes fautes d'orthographe que le gène du collagène 7. Notre stratégie consiste à supprimer une petite partie de l'ARN messager qui contient les fautes d'orthographe. Cette approche est appelée « saut d'exon ». Bien que l'ARN messager soit légèrement plus court que la normale, il peut toujours être utilisé pour fabriquer la protéine de collagène 7. Bien sûr, cette protéine sera également légèrement plus courte que la normale, mais c'est toujours mieux que de ne pas avoir de protéine de collagène 7 du tout.
Le saut d'exon utilise de petites molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO) qui collent à la copie d'ARN messager du gène du collagène 7 et incitent les cellules à supprimer la partie où se trouvent les fautes d'orthographe. Nous avons conçu plusieurs ASO et montré qu'ils sont actifs au saut d'exon lorsqu'ils sont ajoutés à des cellules de peau humaine cultivées en laboratoire. Nous avons également pu démontrer que les ASO sont actifs dans la vraie peau humaine (peau de déchets chirurgicaux). Cependant, la quantité de sauts d'exons que nous pouvons détecter dans la peau est faible et les ASO semblent fonctionner légèrement différemment dans la peau par rapport aux cellules cultivées en laboratoire.
Au cours de la dernière année, nous avons optimisé une méthode qui nous permet de suivre la façon dont un ASO est distribué lorsqu'il est injecté dans la peau humaine. Cette méthode nous a appris qu'un ASO qui a été injecté dans la peau humaine a en effet voyagé du derme (la couche profonde de la peau où l'ASO a été injecté), aux cellules de l'épiderme (la couche supérieure de la peau), où l'exon saute doit avoir lieu. Ce résultat nous a en outre convaincus que le traitement ASO peut effectivement induire un saut d'exon dans la vraie peau humaine. Encore une fois, ce fut un résultat encourageant. Cependant, la quantité de sauts d'exons que nous avons détectés dans la peau était faible et les ASO semblent fonctionner légèrement différemment dans la peau par rapport aux cellules cultivées en laboratoire. Par conséquent, nous nous concentrons maintenant sur l'amélioration de l'efficacité du saut d'exon dans la peau.
L'année dernière, nous avons également conçu et testé 37 nouveaux ASO contre l'exon 13 dans les cellules de la peau pour voir si nous pouvons identifier un ASO qui fonctionne encore mieux que ceux que nous utilisons actuellement. Nous avons également conçu 33 nouveaux ASO contre l'exon 15 pour les tester de la même manière. Les résultats préliminaires ont identifié plusieurs ASO qui montrent une activité de saut de l'exon 13 et donc ceux-ci seront étudiés plus avant. (D'après le rapport d'étape de 2022.)

Nouvelle technologie antisens pour EB – amélioration du saut d’exon dans la peau humaine (Années 3-4).

L'objectif principal est maintenant d'étudier si les ASO fonctionnels peuvent induire le saut d'exon du gène COL7A1 et le silençage de la copie mutante de l'ARN KRT14 lorsqu'ils sont appliqués sur la peau humaine (en utilisant des restes de peau provenant d'interventions chirurgicales). Cela implique d'étudier les moyens de délivrer ces ASO au bon endroit dans la peau. Par conséquent, le boursier travaille en étroite collaboration avec l'équipe du Dr Hickerson.
Les principaux objectifs de la bourse de recherche clinique à l'avenir sont les suivants :
• Induire le « knockdown » de l'ARNm mutant KRT14 pour traiter l'EBS (pour travailler sur l'élimination de l'ARN messager de la kératine qui porte la mutation).
• Sauter les exons qui contiennent des mutations dans le gène COL7A1 pour traiter le RDEB (pour inciter les cellules du corps à retirer ou à ne pas lire la partie du gène où se trouve la mutation).

Les patients atteints de l'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (RDEB), maladie génétique de la peau, souffrent d'une peau extrêmement fragile en raison de l'absence d'une protéine clé (collagène 7) qui maintient les couches de la peau ensemble. Chez les patients atteints d'EBDR, des fautes d'orthographe ("mutations") dans le gène qui code pour la protéine de collagène 7 empêchent l'organisme de la fabriquer.

Au cours de ce projet, nous avons essayé d'inciter les cellules à contourner les fautes d'orthographe dans le gène du collagène 7. Pour ce faire, nous avons ciblé une étape importante qui se produit avant la fabrication d'une protéine. Un gène doit d'abord faire une copie portable de lui-même, cette copie est appelée ARN messager et est utilisée par les cellules comme matrice pour fabriquer la protéine. Chez les patients RDEB, la copie de l'ARN messager contient les mêmes fautes d'orthographe que le gène du collagène 7. Notre stratégie consiste à éditer la petite partie de l'ARN messager qui contient la faute d'orthographe. Nous appelons cette approche "saut d'exon". En modifiant l'ARN messager de cette manière et en se débarrassant de la faute d'orthographe, les cellules peuvent désormais fabriquer la protéine de collagène 7. Bien sûr, cette protéine sera légèrement plus courte que la normale, mais c'est toujours mieux que de ne pas avoir de protéine de collagène 7 du tout.

Le saut d'exon utilise de minuscules molécules appelées oligonucléotides antisens (ASO), qui se collent à la copie d'ARN messager du gène du collagène 7 et incitent les cellules à retirer la partie contenant la faute d'orthographe. Nous avons conçu plusieurs ASO et montré qu'ils sont capables de provoquer un saut d'exon lorsque nous traitons des cellules de peau humaine cultivées en laboratoire. Nous avons également essayé de traiter les cellules cutanées d'un patient RDEB avec nos ASO et ils semblent fonctionner de la même manière. Nous pouvons également détecter la protéine de collagène 7 dans ces cellules après traitement avec les ASO, ce qui nous indique que les ASO fonctionnent comme prévu.

Une partie importante du projet a été consacrée à déterminer si les ASO agissent sur la peau humaine. Notre objectif ultime est d'utiliser les ASO pour traiter les patients, il est donc important de savoir s'ils sont actifs dans la peau plutôt que simplement dans les cellules d'une boîte. Avant de pouvoir commencer ce travail, nous avons dû développer des méthodes de détection très sensibles pour capter le saut d'exon car ces outils de recherche n'existaient pas commercialement. Pour les expériences sur la peau, nous avons injecté les ASO dans la peau saine des restes d'interventions chirurgicales, puis avons analysé la peau pour le saut d'exon. Nous avons découvert que les ASO peuvent provoquer un saut d'exon dans la peau humaine, ce qui est bien sûr un résultat extrêmement encourageant. Cependant, le principal défi auquel nous sommes confrontés est que la quantité de sauts d'exons que nous pouvons détecter dans la peau est faible. Les ASO semblent également fonctionner légèrement différemment dans la peau par rapport aux cellules cultivées en laboratoire. Certes nous ne savons pas si le niveau de saut d'exon que nous observons dans la peau est suffisant pour être bénéfique aux patients (seul un essai clinique apporterait une réponse définitive) mais nous pensons qu'il y a encore place à l'amélioration. Par conséquent, dans la dernière partie du projet, nous nous sommes concentrés sur les moyens d'augmenter la quantité de sauts d'exons dans la peau. Nous avons conçu un nouvel ensemble d'ASO pour essayer d'en identifier un qui fonctionne encore mieux que ceux que nous utilisons actuellement, et nous avons également essayé de mélanger les ASO avec un réactif conçu pour faciliter l'absorption des ASO dans les cellules après leur injection dans la peau.

Dans l’ensemble, ce projet a montré qu’il est réellement possible d’utiliser des ASO pour induire un saut d’exon dans la peau humaine réelle. L’optimisation des ASO et l’amélioration de la manière dont ils sont délivrés dans la peau seront nécessaires pour renforcer leurs effets. Si ces obstacles peuvent être surmontés, le saut d'exon comme traitement du RDEB reste une option viable. (À partir du rapport final 2022.)